HIV検査に応用されている検査手法について－２．第三世代抗体検査(1)－

(1)エライサ法

【HIV抗体検査のエライサ法とは】

エライサ法とは免疫学的測定法のひとつで、抗体を使った免疫学的測定法のひとつでもあり、正式名称は，Enzyme-linked immuno-sorbent assay と言います。

エライサとは、このEnzyme-linked immuno-sorbent assayの頭文字のELISAの略称です。

別名酵素免疫測定法とも言われますがエライサ法の方がよく知られています。

また、EIA法とも呼ばれます。

EIA法は、Enzyme Immunoassayの略称です。

【測定原理】

エライサ法とEIA法の測定原理は同じです。

エライサ法は、マイクロプレートやチューブにHIV抗原を吸着させて検査を行いますが、EIA法はビーズにHIV抗原を吸着させて検査を行います。

エライサ法は抗体と酵素を使った測定法です。

一般的には、96のウェル(穴)を持つマイクロプレートを使い、このウエル内部の表面にHIV抗原を吸着（コーティングとか固相化とも言います）させて使用します。

このHIV抗原は、血清又は血漿中にあるHIV抗体を補足するために使われます。

HIV抗原を吸着したウエルに血清または血漿を加えて一定温度で一定時間放置し、ウエルを薬品で洗浄しそこに酵素標識抗体を加え更に一定温度で一定時間放置し、ウエルを薬品で洗浄し最後に基質を加えてから、酵素標識抗体の発色を機械で測定します。

血清又は血漿中にHIV抗体が存在すれば、ウエルに吸着させたHIV抗原にHIV抗体が結合し、この結合物に酵素標識抗体が更に結合し、発色するわけです。

血清又は血漿中にHIV抗体が存在しなければ、ウエルに吸着させたHIV抗原には何も結合しませんので、酵素標識抗体も結合すること無く発色もしません。

【カットオフインデックス(C.O.I.)の計算】

C.O.I.=(検体の発光量)/C(カットオフ値)

C:HIV 抗体用標準陽性溶液の発光量?0.25

上記の式に基づき検体のC.O.I.を計算します。

【測定結果の判定法】

発光量の測定は全て機械が自動的に行い、カットオフインデックス(C.O.I.)の計算も行ってくれます。

従って陰性、陽性間判定も機械が自動的に行なってくれますから、肉眼で検査する場合と比べて検査を行う人の主観は介在する余地はありません。


【判定基準】

陽性:C.O.I.が1.0以上を示す場合。

陰性:C.O.I.が1.0未満を示す場合。

【利用されているHIV抗原はHIVそのものなのか?】

ウエルやビーズに吸着させているHIV抗原は、ウイルスその物ではなく遺伝子操作によって作られたリコンビナント抗原を利用しています。

あるメーカでは、

HIV-1 Env 13リコンビナント抗原

HIV-1 Env 10リコンビナント抗原

HIV-1 p24リコンビナント抗原

HIV-2 Env ALリコンビナント抗原

の４つのHIVリコンビナント抗原をミックスして使用しています。

HIV検査に応用されている検査手法について－１．イムノクロマト法－

【はじめに】

現在のHIV検査には、

1.リアルタイムPCR検査

2.第三世代の抗体検査

・エライサ法
・PA法

3.第四世代の抗原抗体検査

・酵素免疫測定法
・エライサ法

4.迅速抗原抗体検査及び迅速抗体検査

などがあります。

多くの方からHIV検査とその検査手技についての質問を受けますので、数回に分けてHIV検査の手技について解説していきたいと思います。

今回は第一回目として、イムノクロマト法について解説いたします。

【HIV抗体検査のイムノクロマト法とは】

イムノクロマト法により血漿、血清、全血を使用してこれらの中に存在する抗HIV‐1抗体及び抗HIV-２抗体を検出するキットです。

日本において厚生労働省から認可を受けているキットは、アリーアメディカルから販売されている『ダイナスクリーン』一つしか存在しません。

【測定原理】

検体(血液・血漿・血清)中の抗HIV抗体は、シート下部のセレニウムコロイド標識HIV抗原と反応し、抗HIV抗体－セレニウムコロイド標識HIV抗原の結合物を形成し、この結合物はシート上を移動して、シート上部に固相化されたHIV抗原と結合し、固相化HIV抗原－抗HIV抗体－セレニウムコロイド標識HIV抗原のサンドイッチ型の結合物を形成します。

その結果結シート上の判定窓に出現するセレニウムコロイド由来の赤色のラインの有
無を目視で判定します。

この場合、必ずコントロールラインに赤色のラインが出現している必要があります。

コントロールラインに赤色のラインが認められない場合は、検査が正しく実施されていないことから、再度検査を実施する必要があります。

【測定結果の判定法】

シートの各ストリップ上には、上下に分かれて 2 つの判定窓があり、この 2 つの窓を観察し、赤色のラインの有無を確認する。

結果を判定する前に、測定操作が正しく行われたことを確認するために、ストリップ上部のコントロール窓の中に赤色のライン（コントロールライン）が現れていることを必ず確認する。

コントロールラインが認められる場合は検査結果は有効であるが、認められない場合は検査結果は無効とし、再検査を行う。

※判定ラインに赤色のラインが認められた場合は、赤色の強弱にかかわらず陽性と判定する※

※判定ラインの赤色の強さは、HIV抗体の力価を定量的に反映しません※

※定められた判定時間15分を経過後、判定ラインに薄くラインが出現しても陽性とは判定しない※

【判定基準】

陽　性：ストリップ上部の判定窓の中に赤色のコントロールラインが認められ、ストリップ下部の判定窓の中に赤色のライン（判定ライン）が認められた場合

陰　性：ストリップ上部の判定窓の中に赤色のコントロールラインが認められ、ストリップ下部の判定窓の中に赤色のライン（判定ライン）が認められない場合。

再検査:ストリップ上部の判定窓の中に赤色のコントロールラインが認められない場合。

【イムノクロマト法の欠点】

判定ラインの色調を肉眼で判定することから、どうしても判定者の主観に左右されてしまいます、その結果神経質的に判定すればどうしても薄くラインが有ると判定し偽陽性反応が出現しやすい検査法です。

逆に大雑把な人が判定すれば、薄い判定ラインを見逃すこともあります。

しかし、判定を厳格に見すぎての偽陽性反応が圧倒的に多いのが現実です。

【イムノクロマト法　『ダイナスクリーン・HIV-1/2』の判定方法】

以下を参照下さい。
　↓　↓
【イムノクロマト法　『ダイナスクリーン・HIV-1/2』の判定方法】

寄生虫感染症検査－５．マラリア原虫－

【マラリア原虫とは】

分類学上ではプラスモディウム（Plasmodium）属に入る寄生性の単細胞生物です。

マラリア原虫は、ウイルスでも細菌でもない寄生虫でヒト以外にチンパンジーやアカゲザルなどの霊長類、ニワトリやペンギンなどの鳥類、ハ虫類などに寄生するものが数百種類存在しますが、ヒト以外に寄生するマラリア原虫は、例外を除いてヒトには感染することはありません。

【マラリアの分類】

熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、卵形マラリア、四日熱マラリアの4種類が存在します。

これら４種のマラリアは、形態が異なるので比較的容易に鑑別診断が可能です。

熱帯熱マラリア以外は重症化することは稀ですが、熱帯熱マラリアは重症化しやすく、発症してから5～6日間不適切な治療で経過すると、痙攣や昏睡などの脳症、肺水腫、急性呼吸窮迫症候群、急性腎不全、重症貧血、循環不全によるショック代謝性アシドーシスなどの重篤な症状や合併症を呈する重症マラリアとなり、最終的に死に至ることがあります。

【マラリアの種類による発熱発作の周期】

マラリアの種類によって独特の発熱周期が見られます。

熱帯熱マラリア 不規則

三日熱マラリア 48時間

卵形マラリア 48時間

四日熱マラリア 72時間


【マラリア原虫の感染経路と寄生部位】

ハマダラカの体内で増殖したマラリア原虫のスポロゾイト（胞子が殻の中で分裂して外に出たもの）は唾液腺に集まる性質を持つことから、ハマダラカに吸血される際に蚊の唾液と一緒に大量の原虫が体内に送り込まれます。

血液中に入ると45分程度で肝細胞に寄生し、肝細胞の中で1～3週間かけて成熟増殖し、分裂小体（メロゾイト）が数千個になった段階で肝細胞を破壊し赤血球に侵入します。

赤血球の中で８～32個に分裂すると赤血球を破壊して血液中に出るサイクルを繰り返します。

したがってマラリアで発熱するのは、マラリア原虫が人の赤血球を破壊することにより起こるわけです。

【マラリアの現状】

現在では、日本やヨーロッパなどの温帯地域はマラリアの流行はありません。

熱帯、亜熱帯地域の70か国以上で流行しています。

患者は、全世界で年間３～５億人、累計で約８億人の患者が発生し、死者数は100～150万人に上ると報告されています。

現時点では、日本やヨーロッパなどの温帯地域はマラリアの流行はありませんが、地球温暖化による温度の上昇で温帯地域の温度が上昇すればマラリア原虫を媒介するハマダラカが発生し、マラリアの流行が起こり始めると専門家は危惧しています。

【日本国内でのマラリア】

日本でのマラリアは、『輸入熱帯病』としてのマラリアで、海外で感染して帰国するケースが多く年間100例ほどが報告されています。

【治療】

マラリアの治療薬としてはキニーネが有名ですが、クロロキン、メフロキン、ファンシダール、プリマキン等がありますが強い副作用があるので注意が必要です。

【感染予防対策】

第一に蚊に刺されないようにすることです。

マラリア流行地から帰国後、１～２週間後に高熱が発生した場合はマラリアが疑わることから、直ちに受診する必要があります。

マラリアワクチンは、日欧米の数社から発表されその有効性が期待されています。

【マラリア原虫の検査】

１．顕微鏡下でギムザ染色した赤血球内のキラリア原虫を調べる。

２．海外ではイムノクロマト法による迅速抗原検出キットが発売されており、15分以内で検査が終了し、熱帯熱マラリアと他の3種類を区分できます。

※イムノクロマト法を利用した簡易キットとして、ICT　Malaria P.f./P.v.R(オーストラリア製)、OptiMALR(米国製)などがありますが、日本では承認されていせん※

３．実験室レベルでは種々のPCR法も開発されています。


【マラリアと輸血】

平成6年12月鹿児島県で開催された第36回日本熱帯医学会総会において、血小板輸血によって熱帯性マラリアに感染した症例が報告されています。

献血された血液のマラリア原虫の検査は、行われていませんので輸血によるマラリア感染は今までにも報告されており、今後も発生する可能性があります。

従って赤十字血液センターでは、献血者の問診を行うことにより、輸血によるマラリアの感染を防ぐよう努めていますが、完全に感染を防止することは不可能です。

寄生虫感染症検査－４．横川吸虫－

【横川吸虫とは】

横川吸虫は、小腸に寄生する人体寄生虫の1種で成虫の体長は1-1.5mmでほぼ楕円形で、雌雄同体です。

横川吸虫という和名は、明治44年に台湾のアユからはじめてこの寄生虫を発見した医学者横川定(1883～1956)に由来します。

日本では近年減少傾向にありますが、依然感染報告者数第2位の寄生虫(因みに第1位はアニサキス、第3位は広節裂頭条虫)です。


【横川吸虫の感染経路】

人間の便の中にあった横川吸虫の卵が淡水産のカワニナの中でふ化し、その後いろんな形態を経ながら(虫卵→ミラキジウム幼生→スポロキスト幼生→セルカリア幼生)アユやシラウオなどの淡水魚の体内に入り感染型の幼生になり、この魚を人間が生や加熱不十分な状態で食べる事により感染します。

【横川吸虫の寄生部位】

口から取り込まれ小腸まで移動して感染し、小腸に寄生し成虫となります。

【症状】

横川吸虫の少数感染の場合は、ほとんど自覚症状がない人が大半だと言われています。

症状としては、多少下痢が多くなる程度なのでこれが感染による症状とは殆どの人が気づいていないのが現実です。

度重なる感染で寄生数が多くなると下痢や腹痛、食欲不振、体重減少等の消化器症状(横川吸虫症)を引き起こします。

また、小腸の絨毛の間に侵入することが慢性炎症につながるとする説もあります。

【治療】

早朝空腹時にプラジカンテルを投与し、約2時間後に下剤を与えて排泄を促すのが有効な治療法とされています。

【感染予防対策】

１．中間宿主となるアユやシラウオをなどを生で食べない。

※横川吸虫の少数感染では深刻な症状を起こすことが稀で、成虫の寿命も短いために採り立てて真剣に感染予防の措置がとられていないのが現状です※

２．生焼け状態の組織に少数のメタセルカリア幼生が生存していたり、アユを調理したまな板に、脱落した鱗などからメタケルカリア幼生が付着して他の食材に付着して感染源となることが報告されています。

３．近年では、生シラウオが鮮度を保った状態で流通するため感染者数が増加してます。

【横川吸虫の検査】

疑いのある患者の便を用いて、遠心沈殿集卵法により虫卵を検出します。

横川吸虫が感染していても、成虫が自然に排出されて虫卵が検出されなくなることもあります。

血清検査は行いません。

【判定】

便の中に横川吸虫の虫卵があれば、横川吸虫に感染していると判断します。

謹賀新年

多くの方にとって役立つ臨床検査についての事項を解説していきますので、今年もよろしくお願い致します。

寄生虫感染症検査－３．赤痢アメーバ－

【赤痢アメーバとは】

主にヒト及びサルの大腸に寄生して増殖し、腸管臓器を破壊して宿主に障害を与える腸管寄生性寄生原虫です。

赤痢アメーバはその生活史上、栄養型と嚢子（シスト）の２形態に分類され、ヒトへの感染は糞便中の成熟シストが経口摂取され回盲部辺りを中心に、大腸管腔で増殖・定着感染します。

熱帯や亜熱帯の発展途上国を中心に多くの患者の発生が認められているますが、先進国では性行為やオーラルセックスで感染が広まっています。

※赤痢菌が原因の「赤痢」とは別のものです※

【赤痢アメーバの感染経路】

赤痢アメーバのシストに汚染された飲食物等の経口摂取により感染します。

また、ヒトからヒトへの直接感染も起こります。

性行為では、肛門と口唇が直接接触すること(リミング)によって、口から感染します。

日本の男性同性愛者間では、赤痢アメーバ症と梅毒やHIVなど、他の性行為感染症との複合感染も少なくありません。

※※日本の３大都市で同性愛者の56％がHIV感染者で，そうち45％が症状がある赤痢アメーバ症であったとのデータが有ります※※

【赤痢アメーバの寄生部位】

大腸や肝臓に寄生し、赤痢アメーバ性の大腸炎や肝膿瘍を引き起こします。

【感染の実態】

他の寄生虫感染症に比べ、日本でも多くの感染が発症しており、年間700から800人(死亡者は
年間数例)の届け出があり、４?５年前と比較すると約1.7倍増加しています。

日本での感染者の８から９割は海外渡航歴がなく、ほとんどの場合が男性同性愛者です。

【症状】

男女共に同様の症状が見られます。

１．大腸感染

下痢

イチゴゼリーのような粘血便

渋り腹)排便するものがないのに便意をもよおし、何回もトイレに通う)

排便時の下腹部痛

２．肝臓感染

赤痢アメーバ性肝膿瘍

肝臓の一部に炎症が起こり、その組織内に膿が溜まる。

38度以上の発熱

上腹部痛

肝腫大

寝汗

【治療】

メトロニダゾール、テトラサイクリンなどを投与する。

【感染予防対策】

飲食物の加熱、手洗いの励行、そしてリミングをしないこと。

消毒は塩素の場合，細菌を殺すには十分な濃度でも赤痢アメーバの嚢子は殺せませんが、水を煮沸すれば嚢子も死滅します。

【検査】

1)赤痢アメーバ性大腸炎の場合は便を検査し、粘血便を伴う症例では栄養型を、軽症例や無症状キャリアではシストを顕微鏡下で調べます。

検出感度は低いため、連続３日程検査を行う必要があります。

2)赤痢アメーバ性肝膿瘍の場合は、超音波やCT検査で膿瘍を証明し、穿刺やドレナージにより採取した膿瘍液中にアメーバ（栄養型）を調べます。

3)血清赤痢アメーバ抗体を調べます。

血清アメ－バ抗体の陽性率は大腸炎で50～90％、肝膿瘍では95％以上と高く有用な検査です。

画像診断と併せて鑑定診断に用いられます。

※血清アメ－バ抗体検査でIgG抗体を検出する場合は抗体価のレベルに注意する必要があり、低くて陽性下限に近い時は糞便検査のデータと併せて総合的に判断する必要があります※

※IgM抗体が検出されたら初感染早期を疑う※

4)現在では、免疫酵素抗体法による赤痢アメーバの主要抗原蛋白質の検出や赤痢アメーバのDNAをPCR法で検出する方法が採用されています。

【注意事項】

赤痢アメーバ症は、便を感染源に経口感染により男性同性愛者間に感染する性行為感染症でもあるため、性的パートナーも同時に検査する必要があります。

寄生虫感染症検査－２．アニサキス検査－

【アニサキスとは】

線形動物門双腺綱桿線虫亜綱カイチュウ目アニサキス科アニサキス属に属する動物の総称で、海産動物に寄生する寄生虫です。

【アニサキスの感染経路】

サケ、サバ、アジ、イカ、タラなどの魚介類から感染する。

【アニサキスの寄生部位】

胃・腸などの消化管に寄生する。

寄生する場所によって、以下のように分類される。

１．胃アニサキス症

２．腸アニサキス症

３．腸管外アニサキス症

４．アニサキスアレルギー

アルサス型のアレルギー反応で、初回感染時は無症状ですが再感染により発症します。

イカ、サバ、ハマチ等を摂取した際、発疹などのアレルギー症状を起こすことがありますが、アレルギー検査で食べた魚介類では陽性反応を示さない場合は、アニサキスによるアレルギーが原因の可能性があります。

【症状】

胃アニサキス症は、食後数時間のうちに始まる激しい腹痛と嘔吐で、嘔吐に際しての吐瀉物は胃液のみで、下痢も一切認められません。

この激しい痛みは、アニサキスが胃壁や腸壁を食い破ろうとするために生ずる症状です。

【治療】

胃内寄生の場合は、胃カメラで消化管粘膜上のアニサキスを確認し、鉗子を用いてアニサキスを摘んで取り除くか、開腹手術を行いアニサキスを取り除きます。

寄生したアニサキスを取り除くことにより、痛みなどの症状が消失します。

特異的な治療薬は現在ではありません。

デカドロンRや強力ネオミノファーゲンシー、セレスタミンRやプレドニゾロンを投与すると症状が軽快するという報告があります。

【感染予防対策】

海産魚介類を生で食べないことと、60℃で1分以上の加熱処理後に食べる。

-20℃，24時間以上の冷凍保存によってアニサキスは感染性を失うので，魚を冷凍して解凍後に生で食することは感染予防に有効とされています。

※醤油・わさび・酢がアニサキス症の予防に有効と一部では言われていますが、料理で使う程度の量や濃度，処理の時間ではアニサキスは死ぬことはありません※

【抗アニサキスIgG･IgA抗体検査】

エライサ法によって血清中の抗アニサキスIgG･IgA抗体を調べます。

内視鏡で虫体を確認できないアニサキス症の診断に用いられます。

【検査の原理】

検体中の抗アニサキス抗体はマイクロプレートに固相されたアニサキス特異抗原と反応し、次に添加されたペルオキシターゼ標識二次抗体と複合体を形成し、固相の抗原に結合した抗体の量は酵素の量に反映されるので、その酵素活性を測定することにより抗体価を計算で求めます。

【判定】

カットオフインデックス1.50以上を陽性とする。

【異常値を示す場合】

アニサキス感染が疑われる。